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His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)

来源:戴安生物 发布时间:2022-08-02 浏览量:100次

注意: 1)填料的上层是乙醇保护层,将填料和乙醇一起混匀,以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋 白计算,取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。 2)如果乙醇不流出,可以给柱子一个外力,例如用大拇指对柱口轻轻按压一下,迫使乙醇流出。 3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。 2. 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后,再用10倍柱体积的 Binding Buffer平衡柱子,平衡结束后即可上样。 注意:柱体积指的是填料的体积。 Ⅲ可溶性蛋白的纯化 1. 收集菌体后,每100 mg菌体(湿重)加入1-5 ml细菌裂解液(每1 ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 蛋白酶抑制剂混合物),超声裂解菌体。

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注意: 1)当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时,建议加入DNase I和Lysozyme。每1 ml 细菌抽提试剂中加入1 μl DNase I(1,000 U/ml),2 μl Lysozyme(50 mg/ml)。 2)超声过程中保持菌液处于冰浴中,超声条件依赖于所使用的超声仪功率,探头种类,容器的大小形状,需实验中自己摸索,应避免连续超声导致的大量产热,可分成短时间,多次超声,通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。 2. 10000 rpm,4℃离心3分钟,收集上清中的可溶性蛋白。 3. 用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱,流速为10倍柱体积/小时,收集流穿液。 注意: 1)本试剂盒中附带有一块筛板,使用时先将筛板加至填料的上层,该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤,防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱,但是筛板放入柱子后就不易取出。 2)通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。

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4. 使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子,洗去杂蛋白。 5. 使用适量Soluble Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰。 注意:洗脱峰可以分管收集,每1 ml收集1管,并采用蛋白监测仪监测,收集洗脱峰 6. 洗脱后,依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),封柱后2-8℃保存。 注意:如果是分段梯度洗脱,最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM时,则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后,再进行第6步的操作 Ⅳ柱再生 当填料使用多次后,结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色), 可以用以下方法再生,提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

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1. 使用2倍柱体积的6 M盐酸胍冲洗后,使用3倍柱体积的去离子水冲洗。 2. 使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。 3. 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的100%乙醇冲洗,再依次使用1倍柱体积的75%、 50%和25%的乙醇冲洗。 4. 使用1倍柱体积的去离子水冲洗。 5. 使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。 6. 使用3倍柱体积去离子水,3倍柱体积20%乙醇冲洗。 7. 2-8°C保存。 8. 再次使用前,需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗,然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生,3个柱体积的Binding Buffer平衡。

注意事项: 1. 在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性,本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化。 2. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT和EDTA。 3. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。 4. 为提高纯化效率,首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度,Binding Buffer的范围为0-10 mM,洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。 5. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液,并通过0.22m或者0.45m过滤器过滤。为避免柱子被堵塞,建议将裂解液进行离心,或者使用0.22m或者0.45m过滤器过滤。 6. 柱再生时,保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

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1.抗体纯化填料/预装柱/试剂盒 抗体纯化产品包括Protein A, Protein G, Protein A/G, Protein L。

2.蛋白纯化填料/预装柱/试剂盒 蛋白质纯化产品包含His, GST, MBP, Flag, Biotin, Strep II-Tag标签纯化。

3.其它纯化填料/预装柱/试剂盒 包含肝素( Heparin)填料、苯甲脒( Benzamidine)填料及内毒素清除填料。

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