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噬菌体展示——完美的纳米抗体发现服务
来源：市场部
发布时间：2022-05-12
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几十年来，从多克隆抗体到单克隆抗体的里程碑式发展，抗体已经被证明是体外诊断和生物制药业发展的核心原料。尽管单克隆抗体发挥着越来越重要的作用，但是单克隆抗体的大分子量（150 kD）使得使用重组方法对其进行重新设计是一项巨大的挑战
纳米抗体（Nanobody），也称单域抗体(SdAb)，是一种来自驼类动物的特殊抗体，仅包含一个重链可变区（VHH, Variable domain of heavy chain antibody），该可变区可以单独稳定地在体外存在。纳米抗体晶体直径为2.5nm，长约4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10（约12kD-15kD）但依然具有完整的抗原识别能力（Tahir S. Pillay et al. 2021）。
（Ross W. Cheloha et al. 2020）
纳米抗体的优势及应用
基于羊驼重链抗体的VHH纳米抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。可以毫不夸张的说，纳米抗体是串联科研抗体，诊断抗体及治疗抗体的纽带。
相比于常规抗体，纳米抗体的优势有：
- 分子量小，可穿透血脑屏障:；
(Bahman Anvari et al. 2021)
一般情况下，由于血脑屏障处Fc 受体（Fcγ 受体，FcγR；新生儿 Fc 受体，FcRn）的存在， IgG抗体无法透过血脑屏障。而纳米抗体没有Fc段，同时生理胞吞机制促进了纳米抗体的透过性，使纳米抗体可以顺利穿过血脑屏障。
- 原核或真核系统中高表达: 纳米抗体的小尺寸，使得其在细菌培养中易于高产量生产。一般可以用大肠杆菌细胞质或者周质表达纳米抗体， 周质表达更容易形成正确的二硫键结构。据统计，周质表达平均产量为 1-20 mg/L，细胞质表达平均产量为 60–200 mg/L甚至更高。 酵母和哺乳动物细胞也经常用于纳米抗体的表达。；
- 特异性强，亲和力高: 可以轻松重新设计编码纳米抗体的基因，以改变其结合特性或表位标记。纳米抗体以高亲和力与靶标结合，有时解离常数在低皮摩尔范围内，有多种方法可用于增加纳米抗体的亲和力或亲合力。
- 对人的免疫原性弱: 纳米抗体由于其与人类 IgG 的序列相似性而具有低免疫原性。纳米抗体的小尺寸使其可以在肾小球中自由过滤，促进排泄。因此，对于非侵入性体内成像或治疗应用，如果纳米抗体被标记有抗癌分子，随着纳米抗体的排出，残留毒性将最小化。
- 稳定性强: 与 IgG 和 ScFv 片段相比，纳米抗体具有出色的热稳定性，因此可以在大多数环境温度下轻松运输。它们的热变性温度 (T m ) 可高达 80°C，有些甚至可以设计为具有高达 90°C的 T m 。一些 VHH（但不是全部）可以在变性后重新折叠和复性至 100%。
- 免疫原性低，易于人源化。纳米抗体对人的免疫原性很低，不易引起严重的免疫反应。同时，纳米抗体也很好的避免了IgG抗体药物的耐药问题。
纳米抗体在以下领域有广泛应用
- 体内成像及肿瘤诊断：分子影像广泛应用于：靶点分布、抗体药物体内分布、肿瘤诊断等领域。
(Quentin Lecocq et al. 2019)
注射68 Ga-HER2-Nanobody后的 PET/CT 扫描（上）和 PET 扫描（下）显示原发性乳腺癌病变（箭头）（AC）和纵隔和左肺门区域淋巴结中的转移性病变（D）摄取和骨盆骨转移（E）
- CarT治疗：纳米抗体由于其分子量小，易于操作，免疫原性低等优点，与传统的scFv相比，更适合用于CarT的靶向性分子。
VHH在先进的CAR-T疗法中的应用，包括双特异性/表位、细胞因子/VHH/VHH-Fc释放和UniCAR等（Chaolemeng Bao et’ al.）。
- mRNA技术：纳米抗体非常适合用于mRNA相关的药物及研究开发，已有用于VHH-mRNA用于呼吸道合胞病毒治疗的报告（Pooja Munnilal Tiwari et al. 2018）。
- 靶向放射治疗：纳米抗体良好的组织穿透性，标记反射性核素靶向肿瘤相关抗原，实现靶向放射治疗。
使用纳米抗体和纳米抗体衍生物靶向癌细胞和血液内皮细胞或调节可以激活（APC，包括 DC 和 1 型巨噬细胞）、发挥（溶细胞性免疫细胞，包括 NK 细胞）的免疫细胞的示意图和 CTLs) 或抑制 (2 型巨噬细胞和 Tregs) 抗肿瘤免疫反应（Quentin Lecocq et al. 2019）。
- 递送化疗药物：与化疗药物偶联，定向输送化疗药物到靶细胞。
已进入临床试验的纳米抗体
- 科研抗体：纳米抗体在免疫沉淀IP，染色体沉淀CHIP等领域有独特优势。近年来关于纳米抗体的相关研究也一直呈上升趋势、
(Quentin Lecocq et al. 2019)
戴安生物建立了完善的哺乳动物细胞蛋白质制备、抗体荧光标记、细胞免疫荧光等技术平台，与噬菌体抗体展示平台一起，形成完整的纳米抗体发现流程，提供一站式，一体化的纳米抗体发现服务。
（Barbara De Coninck et al. 2017）
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案例展示
- 293F表达的蛋白质抗原，小样WB验证及大量纯化结果。
2.抗原ELISA筛选结果
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1-1-2 |
1 |
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10 |
11 |
12 |
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A |
0.102 |
0.089 |
0.119 |
0.131 |
0.167 |
0.186 |
0.069 |
0.068 |
0.108 |
0.067 |
0.102 |
0.066 |
|
B |
0.240 |
0.102 |
0.171 |
0.060 |
0.054 |
0.080 |
0.056 |
0.080 |
0.074 |
0.076 |
0.092 |
0.088 |
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C |
0.351 |
0.156 |
0.063 |
0.057 |
0.057 |
0.055 |
0.162 |
0.271 |
0.120 |
0.118 |
0.070 |
0.102 |
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D |
0.168 |
0.152 |
0.070 |
0.063 |
0.064 |
0.057 |
0.117 |
0.083 |
0.161 |
0.065 |
0.073 |
0.145 |
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E |
0.348 |
0.170 |
0.062 |
0.058 |
0.057 |
0.056 |
0.066 |
0.189 |
0.087 |
0.058 |
0.117 |
0.111 |
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F |
0.103 |
0.234 |
0.061 |
0.055 |
0.066 |
0.058 |
0.108 |
0.106 |
0.063 |
0.147 |
0.159 |
0.075 |
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G |
0.112 |
0.129 |
0.057 |
0.059 |
0.092 |
0.060 |
0.058 |
0.054 |
0.062 |
0.112 |
0.136 |
0.139 |
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H |
0.090 |
0.180 |
0.068 |
0.064 |
0.056 |
0.058 |
0.047 |
0.057 |
0.063 |
0.049 |
0.077 |
0.083 |
- 一批纯化的纳米抗体
我们的优势
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