1、首先，观察细胞培养瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象。若有，请拍照，并及时与技术支持联系（所拍照片将作为后续服务依据）。

2、用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落；先不要打开培养瓶盖，将细胞置于细胞培养箱内静置培养2-4小时，以便稳定细胞状态。

3、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如贴壁特性（贴壁/悬浮）、细胞形态、所用基础培养基、血清比例、所需细胞因子、传代比例、换液频率等。

4、静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照，记录细胞状态（所拍照片将作为后续服务依据）；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

5、贴壁细胞：若细胞生长密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留5ml左右继续培养，直至细胞密度达80%左右再进行传代操作，瓶盖可稍微拧松。

6、悬浮细胞：将细胞培养瓶内液体全部转移至50ml无菌离心管内，1200rpm离心5min，离心后上清培养基可收集备用，管底细胞沉淀加入5ml培养基吹打、重悬。镜检时，若细胞密度超过80%，可将细胞悬液分至2个细胞培养瓶内培养，补加培养基至5ml；若细胞密度未超过80%，将细胞悬液移至原瓶继续培养，直至细胞密度达80%左右时再进行传代操作。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

温馨提醒：

1、可将培养瓶内多余的培养基转移至50ml无菌离心管中，备用；细胞首次传代时，可以将该培养基按照一定比例和客户自备的培养基混合使用，让细胞逐渐适应培养条件。

2、确认细胞状态良好后，应及时将部分细胞冻存，再进行后续的实验，避免后期实验失误可能发生细胞污染或死亡而导致的细胞丢失，影响后续实验。

3、建议客户收到细胞后前3天，100X、200X、400X各拍3张细胞照片，记录细胞状态，便于后续和技术支持沟通交流。

细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml细胞培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 对于贴壁细胞，传代可参考以下方法： 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

1. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

2. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

下面T25瓶为例：

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

４.细胞运输和保存：可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：（1）干冰运输，收到后立即转入液氮冻存或直接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

如何获得关于我的蛋白的一些相关信息？

生命科学发展在现在，很多蛋白质都已经被研究过了或者正在被研究，对于已有前人研究基础的蛋白质，我们可以借助NCBI和UniProt了解蛋白的结构及翻译后修饰等相关信息，对于未被研究的蛋白质，我们可以借助一些预测网站或软件分析蛋白质的信号肽，疏水性，拓扑结构，等电点等信息。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

用于表达蛋白的基因是钓取野生型还是通过基因合成获得？

多数氨基酸都有一个以上的密码子，通过E.coli密码子应用情况的分析表明一些密码子很少被使用，尤其是Arg，IIE，Leu，Gly，Pro等氨基酸的部分密码子。一个或多个tRNA的稀有或者缺少可能导致翻译的终止， 尽管含有少量稀有密码子不会给目的蛋白表达造成太大的影响，但是如果一个蛋白基因中含有多个或者成串稀有密码子的时候，目的蛋白的表达将会非常低。如果是基因是野生型的，我们最好先对其做个稀有密码子分析，如果密码子稀有的程度不高，可以使用Rosetta菌株用于表达这些含稀有密码子基因的目的蛋白。如果密码子稀有程度过高，最佳的处理方式是经过密码子优化后直接进行基因合成。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒

大肠杆菌在表达蛋白过程中越来越少？

主要可能有两种原因，一种是大肠在加入IPTG等诱导剂后大肠停止生长或者裂解，这时候我们要考虑蛋白本身对该菌是有一定毒性的，这时候我们可以选择一些采用严紧控制的宿主菌株，比如带有pLysS的菌株。另外一种原因就是很令人头疼的了，当我们发现出现大面积摇瓶中细菌量逐渐降低甚至培养基回复到澄清状态，就应该怀疑噬菌体污染的可能性了。中和抗体定制,修饰性抗体定制,标签蛋白纯化试剂盒