哺乳动物细胞蛋白表达,抗体测序及表达,抗体定制

蛋白表达系统

蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。

按照宿主细胞的类型，可将蛋白表达系统大致分为：

1.原核表达系统

2.酵母表达系统

3.植物表达系统

4.昆虫表达系统

5.哺乳动物细胞表达系统

 

发展现状

部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。

已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等，有些产品已投入临床应用或试用。

虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。

 

应用领域

哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台。

哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。

 

哺乳动物细胞表达系统

与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然高等生物蛋白质分子。

优点：

1.重组DNA易转染，遗传稳定，可重复。

2.识别和去除内含子。

3.进行翻译后修饰：磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠。

4.产品的构型正确率高，可被改造成类人体原性，免疫原性好。

5.可分泌至培养基，提纯工艺简单。

6.可用于基因治疗。

 

与其它表达系统相比，哺乳动物细胞具有明显的优势，但是其表达量低仍是其最大的瓶颈，以及生产周期长和生产成本高等缺陷目前，通过各种生物技术手段提高哺乳动物细胞表达量，以减少成本缺点。

缺点：

1.生产周期长。

2.蛋白产量低。

3.生产成本高。

哺乳动物细胞的生长特性

正常的哺乳动物细胞具有下列四大生物学特性：

1.锚地依赖性：细胞必须负在固体上或固定的表面才能生长分裂。

2.血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能正常生长。

3.接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制。

4.形态依赖性：细胞成扁平状，并有长纤维网状结构。

上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞成长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞称为细胞系。

 

哺乳动物宿主细胞的条件

以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物宿主细胞应具备以下条件：

1.细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大规模培养。

2.遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存。

3.合适的标记：便于转化住株的筛选和维持。

4.生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。

5.安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。

 

常用的宿主细胞

常用的非淋巴类细胞有中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、小仓鼠肾（BHK）细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。

不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。

 

CHO

至今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。

CHO细胞属于成纤维贴壁细胞，既有贴壁细胞的所有特点，又因为其为成纤维细胞，表达外源蛋白，很少分泌内源蛋白，有利于下游的蛋白分离纯化。

CHO-k1是CHO衍生而来的一种细胞，广泛的运用于各种实验中，它的培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，一般用来研究哺乳动物基因功能的研究。

 

CHO细胞作为使用最广泛的表达宿主，具有以下优势：

1.遗传背景清楚，生理代谢稳定。

2.与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确。

3.基因转移和载体表达系统完善。

4.耐受剪切力，便于大规模培养。

5.被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞。

6.由于CHO细胞的永生性及其他多种优点，超过70%的重组蛋白是用CHO细胞生产。

HEK293

293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株，多用于瞬时转染表达重组蛋白。

相比CHO 细胞而言，生长更快，生长密度更高，转染效率和外源蛋白表达量较高遗传背景清楚，生理代谢稳定。

贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养。

在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度较低的培养基中。

具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性。

 

COS

COS cell lines 是源于非洲绿猴肾成纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞系。最常用的COS cell lines 是COS-1 和 COS-7。

COS细胞是进行源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载体易于组建，便于使用而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。

 

MDCK

近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：

如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)。Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。