在重组蛋白表达中，选用合适的蛋白标签可控制蛋白质固定的空间取向、简化蛋白质的纯化过程以及方便检测、使体内生物事件可视化，提高重组蛋白的产量、增强重组蛋白的可溶性和稳定性等。

       根据自身分子量大小的不同，亲和标签可分为两大类: 一类是结合固定化配基的短肽标签，如Strep-tagⅡ、FLAG-tag、His-tag等; 另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如MBP、GST等。而根据结合配基分子量大小的不同，亲和标签也可以分为两大类: 一类是与小分子配基结合的短肽或蛋白标签，如结合固定化金属的His 标签、结合固定化谷胱甘肽的GST 标签等; 另一类是与蛋白配基结合的短肽标签，如结合固定化钙调蛋白的CBP 标签等。

Flag标签系统

       今天讲的Flag标签，是通过DNA基因重组技术将一个短的亲水性八氨基酸短肽(DYKDDDDK)，分子量约为1.0kDa，融合到目标蛋白中，从而形成融合蛋白。Flag标签可添加到蛋白质的N端或C端，由于尺寸小，亲水性强，不会对蛋白表达、蛋白水解成熟、抗原性等造成影响，可广泛运用于各种细胞类型中，包括细菌、酵母及哺乳动物等。Flag标签抗体能够特异性的与标签蛋白上的Flag标签结合，用于标签蛋白的纯化、定性定量检测蛋白表达水平、细胞内定位等实验。

Flag标签的特点：

1.序列较短，仅有八个氨基酸序列，只用一条人工合成的寡核苷酸链就可以编码。

2. Flag标签融合蛋白的构象，在结晶条件下与单纯目的蛋白的构象几乎一样，一般不会与目的蛋白相互作用，对目的蛋白的性质和功能影响甚微，这一优势特点便于利用Flag标签对融合蛋白进行下游研究。

3.融合Flag标签后，可直接通过标签对目的蛋白进行亲和层析，通过非变性纯化条件，可纯化得到活性融合蛋白，且具有较高的纯化效率。

4. Flag抗体可特异性与标签蛋白上的Flag标签结合，可在ELISA、WB等实验中对含有Flag的融合蛋白进行有效检测、鉴定。

5. Flag-Tag序列中含有一个肠激酶（enterokinase）切割位点（DDDDK-X1），肠激酶可识别标签中C端的五个氨基酸( Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，通过肠激酶处理切割标签后即可获得天然的非融合蛋白质。

Flag标签的作用原理：

Flag-Tag虽序列简单，但其中的8个氨基酸的排列并非随意，其位置和序列与Flag的抗原作用密切相关。

1. Flag-Tag序列的第二个氨基酸是酪氨酸(Tyr)，为芳香族氨基酸，是抗原-抗体特异性反应的主要因素。

2. N端带负电的天冬氨酸(Asp)与酪氨酸(Tyr)左侧相连，相比于在低极性环境中，在高极性环境中参与抗原性位点的芳香族氨基酸产生作用的可能性更高，Asp可以辅助Tyr的抗原性。

3. Tyr下游的六个氨基酸残基( Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)是一个六肽序列KDDDDK，形成了一个高度暴露的三维结构，达到最大的亲水性，从而使Flag融合标签展示出很强的抗原性。

通过这样一个特殊有序的氨基酸序列，Flag-Tag以最短的形式高效地展示出表达亲和标签的作用。

抗Flag标签抗体

根据不同的抗原结合要求，目前已开发出3种Flag标签抗体并上市使用，分别是M1、M2和M5。

• M1单抗是最早被应用的，常用于N端融合Flag标签的融合蛋白的纯化和鉴定。M1单抗的结合主要在前四个氨基酸，并要求具有自由的N末端，且必须在Ca2+的参与下才能和Flag抗原结合。

• M2单抗克服了M1依赖Ca2+的缺陷，与Flag标签的结合不依赖与Ca2+，因此吸附了抗体后的抗原不能被螯合剂入EDTA等从吸附柱上洗脱。该抗体允许Flag序列前面有多余的氨基酸如Met存在，它的优势是可应用于在真核系统表达中具有N端Met-Flag-结构的重组蛋白，还可以识别并结合C端融合Flag标签的重组蛋白。

• 与单抗M2的作用特点类似，M5单抗（戴安货号：2064）不依赖于Ca2+，多应用于类似N-Met-Flag-C的序列，对融合蛋白的亲和力非常高，是用于检测在真核细胞质表达的Flag融合蛋白质的首选抗体。

Flag标签抗体的应用

1. 应用于融合蛋白的纯化和检测：抗Flag融合标签抗体（戴安货号：2064）与目的蛋白的特异性结合，可对蛋白进行亲和纯化（戴安Flag标签蛋白纯化试剂盒货号KAP0064）；也可直接通过酶联免疫吸附实验( ELISA)、免疫印迹（WB）等方法检测表达产物的蛋白质水平。

Flag标签鼠单抗 WB检测（CAT:2064）

Flag融合标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白结果（Cat：KAP0064）

2. 应用于相互作用的蛋白质挖掘：将抗Flag标签的抗体进行荧光标记后，用于寻找与融合蛋白相互作用的蛋白，包括配体或者受体；利用Flag标签抗体沉淀与目的蛋白相互作用的蛋白，通过分离纯化与鉴定，便于进一步的结构及功能分析，获取更多互作蛋白信息。

3. 应用于蛋白质的结构和功能探索：抗Flag标签抗体可应用与蛋白质分子的功能研究，尤其在膜受体的功能研究领域；可利用抗标签蛋白抗体的交联活化受体代替天然配体来研究受体的信号转导或功能；将标签插入信号转导分子的特定结构域还可以用来研究分子的信号转导途径。

Flag标签抗体相关文献列表(精选）

文献	货号
1. CDK4/6 inhibition triggers ICAM1-driven immune response and sensitizes LKB1 mutant lung cancer to immunotherapy.	2064
2. DIAPH3 condensates formed by liquid-liquid phase separation act as a regulatory hub for stress-induced actin cytoskeleton remodeling.	KAP0064
3. Functional characterization of IL-18 receptor subunits, IL-18Rα and IL-18Rβ, and its natural inhibitor, IL-18 binding protein (IL-18BP) in rainbow trout Oncorhynchus mykiss.	IP0064S
4. Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies SMCHD1 as a Restriction Factor for Herpesviruses.	2064
5. MicroRNA miR-155 inhibits cyprinid herpesvirus 3 replication via regulating AMPK-MAVS-IFN axis.	IP0064, MIP0064
6. SEPT2 Protein Crotonylation Promotes Metastasis and Recurrence Through AKT Pathway in Hepatocellular Carcinoma and is Associated with Poor Survival.	IP0064
7. Retinitis pigmentosa 2 pathogenic mutants degrade through BAG6/HUWE1 complex.	2064
8. Molecular and functional characterization of zinc finger aspartate-histidine-histidine-cysteine (DHHC)-type containing 1, ZDHHC1 in Chinese perch Siniperca chuatsi.	2064
9. Molecular and functional identification of a short-type peptidoglycan recognition protein, PGRP-S, in the Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis.	2064
10. Functional characterization of IL-10 and its receptor subunits in a perciform fish, the mandarin fish, Siniperca chuatsi.	KAP0064