治疗性单克隆抗体（mAb）作为抗感染剂和免疫调节药物，主要用于癌症治疗，是制药行业最活跃的研究和开发领域之一。抗肿瘤抗体药物包括未偶联完整的抗体或片段，抗体药物偶联物，抗体同位素和双特异性抗体等。这些抗体分子不是小分子化学药物，而是复杂的生物学分子，其具有多个并且通常复杂的机制，测量其生物学活性需要专门的技术，因此充分地了解mAb的作用机制进而在早期临床前阶段选择最佳的候选抗体药物是十分重要的。单抗定制,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

众所周知，化合物分子的功能是由其结构决定，mAb也不例外。抗体由抗原结合域（Fab）和可结晶区域（Fc）组成。Fab主要特异性识别肿瘤相关抗原，进而调控下游的信号通路。Fc可以识别并结合表达Fc受体的免疫细胞以及血液中的补体进而介导抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）, 抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）以及补体依赖的细胞毒作用（CDC）等效应功能，Fc还可以结合FcRn从而在体内不被轻易清除而延长了其在机体内的半衰期。在这里根据抗体的结构，我们将其作用机制分为Fab相关的作用机制和Fc相关作用机制。 在这里，我们将介绍目前应用最为广泛的单克隆抗体，即免疫球蛋白（IgG）的作用机制。单抗定制,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

一、Fab相关的作用机制 1）识别游离的靶点的单抗 游离存在于血液循环中的细胞因子、促血管生成因子、生物毒素等都可以作为单抗的作用的靶点。蛋白因子通过与受体的结合，传导信号进入细胞，调控细胞的功能。过量表达的蛋白因子传导过量的信号，打破细胞的正常功能。毒素和病毒等也必须通过与细胞表面的受体结合进入细胞内部从而发挥作用。中和抗体的作用机制就是通过结合抗原进行中和，使抗原丧失结合受体的能力，进而丧失生物学功能。常见的针对游离靶点的抗体有血管内皮生长因子（VEGF）抗体，肿瘤坏死因子（TNF）抗体，炭疽毒素中和抗体等。 2）识别细胞表面受体的单抗 每一种抗体都可以特异性结合特定的抗原靶点。靶点抗原表达在特定细胞表面，具有特定的功能，例如细胞激活、生长或迁移。根据抗体的Fab活性，可以分为结合、拮抗和激活。结合型抗体只是结合在靶蛋白表面但并不影响其功能。因此，靶蛋白受体的配体仍然可以与其结合，从而传递信号。结合性抗体可以用于标记靶细胞，从而让其Fc产生效应功能或通过搭载毒素从而杀灭靶细胞。拮抗性抗体封阻受体上的与配体相互作用所需的表位，阻止配体结合产生的信号传导。常见的那他珠单抗和达替珠单抗均为拮抗性抗体。激活型抗体模拟配体的功能，识别结合靶受体并传导信号至细胞内部。基于被激活的细胞内信号强弱，激活型抗体可能在治疗时使得靶细胞被激活并释放细胞因子，进而产生副作用。单抗定制,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

二、Fc相关的作用机制 单克隆抗体通过其Fc部位结合各种FcᵞRs,进而发挥其效应功能，包括ADCC, ADCP和CDC. 以最常见的IgG1为例，其Fc区域通过结合FcᵞRIII（CD16A）激活NK细胞诱导ADCC；与巨噬细胞上FcᵞRIII（CD16A），FcᵞRII（CD32A）和FcᵞRI（CD64）结合，引发ADCP；与补体的C1q结合激活补体引发CDC。Fc 还能够以pH依赖的方式结合新生的Fc受体（FcRn），避免被核内体降解，从而延长单克隆抗体的半衰期。 图2 单抗隆抗体（IgG1）作用机制(Fc dependent) 1）ADCC ADCC作用是一种细胞介导的免疫防御机制，在靶细胞膜表面抗原结合了特异性的抗体的情况下，激活免疫系统的效应细胞进而裂解靶细胞的作用。因其对已存在的抗体的依赖性，ADCC作用是适应性免疫反应的一部分，也是体液免疫反应的一部分，用于限制和消除感染。经典的ADCC作用由NK细胞介导，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能介导ADCC作用。比如嗜酸性粒细胞能通过ADCC作用杀死某些特定的寄生虫。单抗定制,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

体外检测ADCC效应有几种方法，一种是标记靶细胞的方法：比如用51Cr或具有膜通透性的甲基酯荧光染料，比如calcein-AM or DELFIA-BATDA，靶细胞标记后，加入抗体孵育，然后再加入NK92/CD16A细胞或者从PBMC纯化的NK92，或者PBMC作为效应细胞，不同的效应细胞和靶细胞的比例(E:T)，不同的孵育时间(通常低于4小时，更长的孵育时间也是可以的，只是自发释放会相应变大)。孵育结束后，加入enhancing solution，用不同的仪器检测放射性同位素和荧光染料，这些方法相对可信但灵敏度不够。

单域抗体（single-domain antibody, sdAb）是一种由骆驼或软骨鱼表达的仅具有重链可变区的抗体。单域抗体具有易表达、水溶性好、稳定性强、免疫原性弱等特点，动物实验表明，单域抗体更容易穿透组织，且体内半衰期更短，使其能被理想地应用于各种生物技术和肿瘤临床治疗。单域抗体可以与多种化学物质偶联形成复合型分子偶联的sdAb, 其中包括放射性同位素、荧光染料、生物素、磁珠、亲和基质等，因此可用于多种模式的在体肿瘤成像，在基础研究、探针开发等领域有着广阔的应用前景。 分子影像由于可以用于显示细胞和亚细胞水平的特定靶向分子的成像技术，因此在医学领域极具有应用价值。较CT、经典MRI、X射线等经典影像技术例如而言，分子影像具有较高的灵敏度和特异性，因此临床应用范围广，潜在的研究价值高。目前，分子影像学包括光学成像、PET/SPECT成像、超声造影技术等。可以与靶向分子结合并能产生影像学信号的分子探针影响分子成像的发展，目前常见的分子探针包括与放射性核素、生物素、顺磁性粒子、荧光素等物质化学偶联的多肽、单克隆抗体、寡聚核苷酸等。寻找和研发灵敏度更高、特异性更强、信噪比更高的分子探针是科研人员持续关注的话题。本文总结了一类可以作为分子探针开发方向的抗体——单域抗体（single-domain antibody, sdAb）的基本情况及它在分子成像中的应用，以期为该领域的研究提供帮助。单抗定制,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

1 单域抗体的基本情况 1.1 单域抗体的分子结构 1993年，Hamers-Casterman教授的实验室在分析单峰骆驼血清中的免疫球蛋白G分子（IgG）时，发现了两种不同于IgG1结构的抗体组份：IgG2和IgG3（MW~90 kDa），这两类抗体为缺乏轻链、仅含有重链的抗体（heavy-chain antibod-ies，HCAbs），为重链的同型二聚体(homo-dimeric heavy-chain)，其占所有血清IgG的75%。1995年， Greenberg等研究发现了护士鲨（nurse shark）体内存在大量HCAbs，证实了HCAbs的存在。感染了伊氏锥虫的骆驼的抗体通过放射免疫沉淀和印迹实验显示出IgG2和IgG3的重链部分具有强结合活性。 目前普遍认为HCAbs和传统抗体相比具有如下分子及结构特征。首先，重链的同型二聚体缺少轻链及第一个恒定区，重链可变区抗体Fc段结合通过铰链区链接。一般认为CH1区外显子和内含子边界存在的非剪接位点上的点突变导致HCAbs缺乏CH1区。此外，重链可变区的FR2中有4个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸所取代，即Val42→Phe/Tyr，Gly49→Glu，Leu50→Arg/Cys和Trp52→Gly/Phe，这导致了HCAbs的重链无法与轻链配，也阻止了单域重链抗体 (variable domain of theheavy-chain antibody, VHH)的聚合。此外，VHH有更长的CDR3，VHH的CDR3大致由16~24个氨基酸组成，甚至有些单域抗体的CDR3超过25个氨基酸，相对于传统单抗，其CDR3仅有7~12个氨基酸。这种长CDR3结构形成的凸环有利于单链抗体与抗原分子的隐蔽的抗原表位，这也是提高单链抗体对抗原结合能力的主要原因。同时VHH的CDR3中的Cys和CDR1中的Cys残基可形成额外的环间二硫键，以稳定较长的CDR3。单抗定制,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

1.2 单域抗体的生物学特性 骆驼VHH基因与人类Ⅲ族VH3结构域的编码基因高度同源。因此，骆驼来源的单域抗体在人体中具有更低的免疫原性。此外，单域抗体高热稳定性和重折叠能力较好，在暴露于极端条件下，也表现出高溶解度和重折叠能力。这种能力可能与疏水性氨基酸的突变有关。例如来自美洲驼的咖啡因特异性重链抗体片段（VHH），能够在70℃结合咖啡因，在暴露于高达90℃的温度后仍能恢复其反应性。 单域抗体与常规抗体相比，具有更高的组织穿透率，且血液清除率也更迅速，由于可以快速地到达肿瘤部位，使其能被理想地应用于各种生物技术和治疗。sdAb可以被串联克隆成具有不同特异性的sdAb，例如血清白蛋白，可协助sdAb靶向特定区室，增加试剂的体内半衰期，继而降低给药计量和频率。单价sdAbs可以与放射性同位素、荧光染料、生物素、磁珠、亲和基质等化学缀合。放射性标记的sdAbs可用于体内肿瘤成像。 2 单域抗体在分子影像中的应用 2.1 单域抗体在PET/SPECT中的应用 放射性标记的单克隆抗体（mAb）可用于靶向分子成像探针的制备。但其主要缺点是在血液中的停留时间从几天到几周不等，由于较低的组织穿透率，通常在注射后2-4天，靶组织与周围组织之间才有明显的放射性信号的峰值对比。因此长半衰期的放射性核素如89Zr（t1/2=78.4 h）或124I（t1/2=100.3 h）被用于单克隆抗体放射性标记。89Zr标记的西妥昔单抗用于在晚期结直肠癌患者中的PET显像