一、基因敲降的前期准备工作相同 1.1 生物信息学分析目标基因在斑马鱼早期胚胎发送过程中是否有表达。 1.2 收集斑马鱼早期发育胚胎（通常为 48 hpf 前的胚胎），提取总 RNA，然后进行体外转录（RT）。 1.3 设计检测目标基因表达的 PCR 引物，以 1.2 获得的 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，确认目标基因在早期有表达。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

二、MO 法与 CRISPRi 法的敲降原理不同 2.1 MO 是在转录后水平上敲降基因的功能（MO-Spl 阻遏原始转录本的剪接，MO-Atg 阻遏成熟转录本的翻译）（基因转录后调控） 2.2 CRISPRi 是在转录水平上敲降基因的功能（抑制基因的转录）(基因转录水平的调控）。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

三、敲降工具有效性验证的方法不同

3.1 吗啡啉敲降法（确认有效性）的技术路线 抑制翻译的 MO（MO-Atg）和抑制剪接的 MO（MO-Spl）二者敲降基因的有效性评价方法不同。抑制剪接的 MO（MO-Spl）的有效性评价方法是通过 RT-PCR 直接检测原始mRNA转录本的正常剪接是否被改变；抑制翻译的 MO（MO-Atg）的有效性评价通常需要通过蛋白质印迹法进行检测。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制 但是，由于适用于斑马鱼的抗体很少，过去一般通过报告基因法来进行有效性评价（参见我们发表的论文 Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )， 但后来斑马鱼领域给出的 MO 使用指南（见已发表的研究论文：Stainier et al., 2017. Plos Genetics, 13(10): e1007000）指出这种报告基因评价法缺乏特异性，因而不再推荐该报告基因评价方法。也正是由于没有相应比较方便的评价方法，一般不推荐此种抑制翻译（MO-Atg） 的 MO 敲降法。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

确认抑制剪接的 MO（MO-Spl）敲降基因有效性的技术路线如下：

3.1.1 分析斑马鱼目标基因的基因组组成（外显子-内含子结构），然后针对该基因，设计阻 遏原始转录本剪接的吗啡啉（morpholino）（MO-Spl）。 注：MO-spl 不能阻止母源转录本的翻译，如果要阻止母源转录本的翻译，需要设计阻遏原始转录本翻译的吗啡啉（MO-Atg）。

3.1.2 订购吗啡啉 MO-Spl 或 MO-Atg 和标准对照 MO。

3.1.3 将不同浓度的 MO-Spl 注射入斑马鱼受精卵（标准对照 MO 仅注射最高浓度）抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

3.1.4 待注射胚胎发育至特定时期（优选 48 hpf 前的某些时期），收集胚胎，提取总 RNA， 然后进行体外转录（RT）。

3.1.5 按 1.3 已建立的方法进行 RT-PCR 扩增，确认目标基因的原始转录本的正常剪接是否被阻遏（发生异常剪接）。同时，设置检测管家基因表达作为内参对照，确认整个 RT-PCR 过程正常。 注：如果是使用 MO-Atg，则无简单易行的有效性检测方法（一般不做有效性检测，仅开展特异性检测）。

3.1.6 分析 3.1.5 的实验结果，确定 MO 敲降工具的有效性，以及实现有效敲降的最低注射浓度。 3.2 CRISPRi 敲降法（确认有效性）的技术路线 CRISPRi 敲降的有效性可以通过RT-PCR 法检测目标基因表达水平是否被有效下调来进行直接评价。一般使用普通半定量 RT-PCR 即可，确有需要，可以考虑定量 RT-PCR 法确认敲降程度。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

3.2.1 分析目标基因的基因组结构，确定目标基因转录起始位点和/或 5’UTR 位置。 根据目标基因的转录起始位点的特征，设计 sgRNA 识别位点---CRISRP 序列的设计（不少于 4 个）。

3.2.2 体外合成至少 4 条不同的 sgRNA（每基因）和 dCas9-Eve mRNA。 3.2.3 将 4 条 sgRNA 按不同浓度和 dCas9-Eve mRNA 混合后共同注射斑马鱼受精卵。同时以相同浓度的 dCas9-Eve mRNA 注射受精卵作为空白对照。

3.2.4 待注射胚胎发育至特定时期（优选 48 hpf 前的某些时期），收集胚胎，提取总 RNA， 然后进行体外转录（RT）。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

3.2.5 按 1.3 已建立的方法进行 PCR 扩增，确认目标基因的表达水平是否被有效抑制（阻遏转录）。同时，设置检测管家基因表达作为内参对照，确认整个 RT-PCR 过程正常。

3.1.6 分析 3.2.5 的实验结果，确定 CRISPRi 敲降工具的有效性，以及实现有效敲降的最低注射浓度。

四、CRISPRi 敲降方法的特异性优于 MO 法的特异性 基因敲降方法的特异性需要通过表型拯救的方法来回答。之所以需要表型拯救，是因为需要排除基因敲降的表型是由于敲降工具的脱靶或者敲降试剂本身的毒性而导致的非特异 表型，换句话说，要排除敲降表型是源于基因敲降工具的脱靶或者试剂本身的毒性所造成的 这种可能。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

复杂的基因编辑加上实时高分辨率成像，可以前所未有的分子细节和分辨率对疾病发展过程进行捕捉以及疾病的建模。至关重要的是，对斑马鱼进行精确的基因编辑可以生成人类疾病等位基因的模型，在斑马鱼身上建模的疾病通常代表了人类疾病的真实模型，捕捉了疾病的病因学、进展和解决过程，广泛应用于各种癌症、遗传病、肝脏疾病、心脑血管疾病、血液疾病、心脏病、行为障碍、中枢神经系统疾病等等。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制

人类和斑马鱼之间的疾病蛋白和发病过程是保守的，这意味着在人体内发挥活性的药物分子通常在斑马鱼体内有相同的靶标，特别是与靶蛋白活性区域相互作用的药物，这在针对癌症以及遗传病途径设计的药物中尤其显著，比如MEK抑制剂等靶向疗法；以及日常常备药物如对乙酰氨基酚、5 -羟色胺调节剂；当然，也存在在斑马鱼体内有效但在人体内无效或者在人体内有效但在斑马鱼中无效的现象，这需要在药物发现阶段运用多个模型互相验证。但总的来说，在斑马鱼体内呈现生物活性的药物分子在小鼠和人体系统中也具有同样的药物特性。最近，小分子药物筛选除了在胚胎时期进行，也已经在成年鱼身上大规模进行，体内筛选的能力加上表型与人类疾病的相关性，使斑马鱼成为全动物化学遗传学和药物发现的主要模式动物。抗体测序及表达,单抗定制,斑马鱼抗体定制