01靶点研究、确认 本流程指常规抗体开发流程，不包括通过计算机药物辅助设计获得抗体初始序列。

似乎在抗体行业对于1类新药的词谈得越发少。早十年能做出1类新药的是非常罕见的，但近几年，尤其是抗体药行业，新药已经不足为其。在如此卷的抗体行业，仅只针对PD-1靶点的单抗（不含双/多抗，不含PD-L1），全球研发就有100多家企业在参与，且获批临床或者已经批准的药物就高达44个。（数据来源药融云数据库，截止至2022.07.28）。以NMPA《生物制品注册分类及申报资料要求》的原则，只要氨基酸序列是不同，每一个都是1类新药。 什么才是First in class？笔者狭义的理解为同类第一/首创，即同类型中首个针对该靶点上市的药物，如PD-1抗体FIC就是O药-纳武单抗。由于抗体药不像小分子药物有母核的概念，某几个氨基酸的改变机制完全不同，而后又有双/多抗等多种形式的产生，广义的FIC理解，First与best类似，有同类最优的意思。从临床价值导向的角度，我们更希望最求优而非首创，比如大家熟知的K药是第二款上市PD-1抗体，目前疗效在多个适应症上是较O药更优。 但笔者粗浅的认为，不管是First还是Best，只有探寻相关疾病的发病机制，做好源头创新，找出更核心的靶点，摸透其起效机制，副作用产生机制，找出差异化才能破解内卷，避免资源浪费。国内很难出FIC的产品，本质还是基础研究、机制研究不足，这需要产学研深度结合。噬菌体展示,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

02抗原制备 根据上一期的介绍（带你入抗体药行业（2）——浅谈抗体药靶点和结构选择），抗体主要是针对各类蛋白，因而在抗原制备时，除了一级序列外，需要额外注意其天然折叠形式。若是细胞外的物质，一般是直接根据氨基酸序列进行合成制备，但也需注意是否形成天然的结构形式，如TNF-α天然状态起作用为三聚体形式，那么制备得到的也应是保持活性三聚体形式。 若是膜蛋白，常用四种形式去免疫： 表达膜蛋白的胞外结构域，（该区域也是抗体实际结合的部分。）该方式制备容易，但是缺少跨膜区不易形成正确折叠，尤其是那些多次跨膜的蛋白。 全长蛋白，细胞上表达全长蛋白之后将膜溶解纯化得到目标产物。该方式可尽可能保持天然构象，但制备和纯化均是较困难。 VLP蛋白，将跨膜蛋白组装到VLP（病毒样颗粒）上，该方法可使其保持天然构象，但制备过程也较复杂，收率低。 用高表达该跨膜蛋白的细胞进行免疫，该方式的最大缺点是专一性差，细胞膜上膜蛋白种类较多。 为了保证免疫的成功率，膜蛋白型，会选择蛋白和细胞会共同免疫。 谈完类别，再讲讲种属，一般在免疫时需同时注射人源、鼠源、猴源的蛋白或表达蛋白的细胞，即Human、Cynomolgus、mouse。 终极目的是为了使抗体与人体内的抗原结合，因而必须会有人源的蛋白； 非临床毒理药代研究需要相关种属，食蟹猴一般与人的同源性较高且易得，因而抗体药常用食蟹猴作为模式动物。为使研究更简单，希望最终分子能与食蟹猴蛋白结合； 药效实验常用小鼠进行，便于药效实验实施，同样希望终分子能有鼠源蛋白结合。噬菌体展示,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

03动物免疫 抗原制备完成后，则会进行动物免疫。而动物种属的选择，则是根据所需的抗体结构来选择，1.需要纳米抗体，则会选择免疫羊驼或者鲨鱼（斑竹鲨）。2.普通抗体，则根据选择的技术平台，选择鼠，兔，羊，鸡等。鼠是最初也是最常用得的免疫动物，得益于其繁殖速度快，个头小好操作。 动物免疫利用的是生物体自身的体液免疫应答机制，通过抗原的持续刺激先后启动初级免疫反应和次级免疫反应，实际操作中以血清中抗体效价来衡量实际免疫效果。抗原刺激机体后启动初级反应一般会有一个滞后期，此时幼B细胞经过克隆筛选、增殖，然后分化成记忆细胞或浆细胞。经过滞后期，血清效价呈指数增长达到一个峰值然后下降。初级免疫反应中，会首先分泌IgM，然后经过抗体亚型转换，IgG比例会升高。 次级免疫反应的启动依赖于记忆B细胞和记忆T细胞的数目，记忆细胞再次遇到相同抗原就能被激活，从而导致次级免疫反应的发生。当记忆细胞数目远大于幼B细胞时，次级反应启动更快、强度更大。次级反应相比初级反应滞后期更短，浆细胞和血清效价的峰值更高，持续时间更长。同时，此时分泌的抗体经过亲和力成熟和亚型转换，质量更高。因而一般会采用多次免疫的方式，总次数为5-8次，此外间隔时间也较为讲究，第一次免疫后，一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。 另一个方面，为了增加免疫原性，通常需要先用佐剂进行乳化后再行注射，最常用的为弗氏佐剂，发挥的作用包含①它可能增加抗原的表面面积，易为巨噬细胞所吞噬;②延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机遇;③诱发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。 此外，注射途径、注射部位、抗原用量、动物的年龄和性别也都会影响动物免疫后血清效价情况。 目前抗体筛选技术大致可分为三类，杂交瘤技术，包括小鼠、大鼠、仓鼠和家兔等杂交瘤技术；抗体库技术，包括噬菌体展示抗体库、无细胞分子展示抗体库（核糖体展示、mRNA展示和DNA展示抗体库）和细胞表面展示抗体库（细菌表面展示、真菌表面展示、酵母表面展示和哺乳动物细胞表面展示抗体库）、单B细胞克隆三大类。这三种技术筛选流程.噬菌体展示,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

以下最常用的小鼠杂交瘤制备的详细流程可概括为： 小鼠经免疫全部完成后，在无菌条件下去除脾脏，并完成脾淋巴细胞的制备。 选择与免疫动物相同品系的骨髓瘤细胞进行体外培养。 将两种细胞按一定比例混合后加入PEG进行融合， 放入HAT培养基中进行培养，去除未融合的细胞、融合的B淋巴细胞、融合的瘤细胞，仅保留杂交瘤细胞 利用特定的方法如ELISA等，筛选能产生抗体的杂交瘤细胞。 进行杂交瘤细胞单克隆化已确保得到分泌抗体稳定且完全同质的单克隆，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。最常用的为有限稀释法，如按0.5个细胞/孔进行铺板，尽可能保证每个孔能生长的为单个细胞，通常需要经过2-3轮单克隆化。 利用特定的方法如ELISA、流式细胞法、功能实验等，筛选能产生与所需抗原结合的抗体的杂交瘤单克隆细胞。 杂交瘤单克隆细胞冻存可用于后续生产鼠源抗体，包括腹水法或体内培养法。 另一方面，需对目标杂交瘤细胞所表达的抗体经常测序鉴定，以便于进一步研究优化，右侧展示的流程： 抽提杂交瘤单克隆细胞中的总mDNA， 反转录获得cDNA， 以cDNA为模板，进行PCR扩增得到重链和轻链片段； PCR产物进行TA克隆构建到表达载体里； 将载体进行测序，得到DNA序列，并翻译成氨基酸序列，得到抗体的全长序列。 同时载体可进一步转染至相应细胞内用于生产相应抗体。 至此我们得到了抗体序列（一般小鼠得到的鼠源抗体，转基因小鼠可得到人源抗体），其中最核心的是CDR区域的序列，其决定了抗体的特异性。之后需要做的是通过杂交瘤或转染表达获得更多的抗体，进行更深入的成药性分析，另一方面则是做抗体工程改造，以期实现最终目的。这是一个反复测试的闭环，直至筛选到最合适的分子。 其他筛选流程大同小异，主要也是让抗体或片段表达在相应载体上，进而进行筛选，最终对其进行分子实验基因测序获得抗体或片段序列。受限于篇幅不一一介绍，请查看其他文章或下次有机会再详细介绍。 这里多提醒一点，在这个阶段我们会得到很多目的抗体的CDR区，这时还有一点需考量，就是专利侵权。由于抗体CDR的特异性，各家专利授权保护的抗体内容里必有CDR区序列，因而抽时间做个简单FTO分析，确保CDR序列不存在侵权分析，以免劳民伤财还空欢喜一场。噬菌体展示,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

05抗体改造 5.1人源化改造：如之前文章提及，非人源的部分会引起免疫原性（与动物免疫要求正好相反），普通小鼠杂交瘤得到的是鼠源抗体，人源化改造是指将CDR区域外的其他序列替换成为人源序列，以降低免疫原性，同时需应尽保证亲和力不变。因为替换成程度可成为鼠源抗体（全部鼠源）、嵌合抗体（可变区为鼠源其余均为人源）、人源化抗体（除CDR外全部是人源）。全人源抗体主要是通过最初筛选体系得来，而非通过改造而来，如全球第一个上市的全人源化阿达木单抗，是剑桥抗体技术以TNF-α为抗原使用它们特有的噬菌体展示技术在体外筛选中得到了全人抗体D2E7，而后进行进一步完善得来的。 5.2亲和力成熟：抗体亲和力指抗体的抗原结合簇同抗原的抗原决定簇的结合强度。低亲和力的样品结合慢解离快，这种分子容易造成起效慢、需要较高剂量、易脱靶产生副作用等缺点，因而需要进行亲和力成熟改造（即提高亲和力）。亲和力成熟应用场景如下： 杂交瘤抗体经过多次免疫刺激，会在体内完成亲和力成熟，筛选得到高亲和力的抗体，但受限其免疫原性，需要进行人源化改造，此时会造成亲和力下降。 全人源纳米抗体库往往亲和力较低， 其他筛选后仍出现候选抗体亲和力低 目前亲和力成熟的方法很多，分为为三大类，随机突变、置换和定向突变。包括易错PCR、DNA改组、链置换、定点突变、突变株等 5.3 Fc工程化改造： 最常用的是进行Fc亚型替换，如得到鼠源抗体后，会优先把恒定区替换成人源的，做成嵌合抗体去做相应功能实验。以及评估IgG1\IgG2\IgG4相应的替换改造 与FcRn结合力改造，延长或减缓半衰期 与FcγR结合力改造(含糖基化位点改造)，影响ADCC\ADCP等功能 与C1q结合力改造，影响CDC\CDCP等功能 5.4成药性改造：在成药性评估过程中会出现各类问题，常需要通过定点突变的方法改变。比如 自相互作用/疏水性改造 热稳定性改造 N/O-糖基化 脱酰胺位点/氧化位点等翻译后修饰位点改造 易聚集区域改造 06成药性分析 首先需明确，我们做的是药物，与用于做诊断、检测的抗体是不同的。药物三要素安全、有效、质量可控，也是抗体成药性评估的必须考量的因素。 安全：主要考量是否有非特异性吸附、脱靶效应（亲和力低）、聚集体、颗粒物、N/O某些糖基化引起的免疫原性、以及拮抗或激活靶点本身引起的副作用（如免疫激活型CD3抗体过度激活导致细胞因子风暴）、无法代谢的蓄积毒性等。 有效：主要考量抗体与目标靶点的结合和解离情况、能否抑制或激活下游信号通路（有些抗体结合抗原后，无法阻断抗原与受体的结合）、抗体介导的反应（ADCC\CDC）能否足以治疗疾病、抗体的半衰期使其有足够的时长去发挥疗效等。 质量可控：主要考量在抗体生产、储存、运输、临床使用过程、包括在注射到人体内后的生物、物理、化学稳定性。比如胶体稳定性即抗体自相互作用的情况，若稳定性过差，抗体分子在上述过程中会不断聚集产生可溶和不可溶的颗粒物，影响安全和有效。构象稳定性，即抗体结构的稳定性，若稳定性过差，抗体会解折叠改变原有构象，失去活性，影响有效性。如热稳定性过差，体温37℃的环境即有可能使其失活失去药效，则该分子是万不能成药。 成药性的评价维度众多，评价方法各异，有很多体外的评估方法，受限于篇幅不再详述，可先查看之前整理的《一张表带你了解抗体药物的成药性》，后续有机会再详述。 07动物模型评价 除了体外的评估，为了模拟体内环境，体内的评估也必不可少。我们需要利用模式动物来进行药效、药代、毒理方面的初步评估。啮齿类动物小鼠，因为其具有繁育速度快，成本低，可进行基因修饰等诸多优点，基于其构建的各类模型构成了临床前治疗性药物筛选的主要工具。动物模型是非常复杂的过程，此处仅简要概述流程，能明白大概如何操作即可。（本人非专业做动物，说得不对，轻喷） 以抗肿瘤抗体为例，肿瘤动物模型的建立为研究肿瘤发生与转移的机制、筛选和评价抗肿瘤药物的药效提供了有力的工具。常规的流程是: 了解药物发挥作用的机理，设计合适的方案 让小鼠身体内产生相应的肿瘤细胞或组织，或其他免疫细胞 注射抗体，使其能与相应靶点结合发挥特定功能 评价药效、药代、毒理情况 根据上述的过程至少需要考量： 肿瘤的种类：鼠源的或人源的，原位瘤或转移瘤，肿瘤细胞还是肿瘤组织，肿瘤的类别（乳腺癌、结肠癌等） 肿瘤的构建：包括自发的或诱发的或移植的（鼠源同种移植模型、肿瘤细胞荷瘤模型(CDX)、病人来源异种移植模型（PDX)…..）或转基因动物肿瘤，肿瘤上特定靶点的表达等等 小鼠品系的选择和自身免疫体系：如常用的C57BL/6 还是BALB/C；为了使肿瘤生长不被自有免疫系统杀伤，同时兼顾抗体发挥作用的机理，则需要不同程度免疫缺陷的小鼠，如裸鼠（Balb/c nude）、肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)、重度免疫缺陷鼠（NSG\NOG\C-NKG…..）。 免疫系统的构建：是否可借助鼠源的免疫系统进行杀伤，亦或需要重构人体免疫系统。 靶点的同源性与抗体的交叉情况；如动物免疫那部分提到，因而我们首先需要确认抗体是否有小鼠靶点有交叉反应（即结合），如有可以直接用小鼠试验，否则需选用转基因小鼠，使其表达相应的靶点才可应用。 动物体重分组、剂量的选择、注射部分和注射周期等 评价指标：主要包括抑瘤率（肿瘤重量、肿瘤体积）、活性成像、免疫功能测定（细胞因子、各位免疫细胞测定）、死亡率、血药浓度….. 在成药性评估阶段，主要用于区分不同序列的分子是否有活性差异，探讨药物发挥作用的机制。也常用于概念验证，用于确定后续抗体改造或构建呈双/多抗的可能性。 序列影响结构，结构决定功能，如上谈到抗体会历经不同的改造，杂交瘤会经历鼠源、人源化改造、亲和力成熟、Fc工程化改造以及成药性改造，不同阶段开展的成药性评估方面也不同，如鼠源抗体主要评估CDR区介导的亲和力及对应的细胞功能，化学和物理稳定性可暂不考察。 筛选、改造、评估是一个反复循环过程，最终通过全面成药性评估含动物模型评估后才能成为终分子（氨基酸序列）。若是开发单抗至此即可进入下一个CMC研究和非临床研究阶段； 但若后续开发成双\多抗、ADC等，那么需要进行进一步的设计、工程化改造，继续进入改造/偶联、评估的循环，直至通过全面成药性评估含动物模型评估后才能成为候选药物分子。噬菌体展示,抗体测序及表达,斑马鱼抗体定制

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